Das Problem in der histologischen Schnitttechnik:
Aus Kostengründen wird in der Praxis der apparative Aufwand bei der Anfertigung von Dünnschnitten reduziert, die Mikrotomschnitte sind meistens viel zu dick – Zielwert 5µm.
Oberhalb und unterhalb der Einstellebene bilden sich benachbarte Präparateschichten unscharf ab! In der Fluoreszenzmikrografie erzeugen die leuchtenden, unscharfen Präparateschichten bei relativ langer Belichtungszeit eine leichte Schleierbildung. Die scharf abgebildete Präparateschicht wird um so dünner, je höher die Vergrößerung respektive die Apertur des Objektives ist!
Unser Rat:
Benutzen Sie im Interesse größerer Schärfentiefe im Mikrofoto besser ein schwächeres Objektiv mit geringerer Apertur oder ein Objektiv gleicher Vergrößerung mit geringerer Apertur.
Beispiele:
Apochromat 20x/0,65 … Schärfentiefe 2,3 µm – Achromat 20x/0,40 … Schärfentiefe 6,0 µm
Apochromat 40x/0,95 … Schärfentiefe 1,1 µm – Achromat 40x/0,65 … Schärfentiefe 2,3 µm
Mit steigender Vergrößerung erhöht sich die Objektivapertur. Sie können sich als Faustregel merken:
Die Schärfentiefenbereiche der Mikroskopobjektive verhalten sich dem Quadrat ihrer numerischen Apertur umgekehrt proportional. Bei der Auflicht-Fluoreszenzmethode hat die Verringerung der Objektivapertur eine Verringerung der Sekundärfluoreszenz und damit eine Verlängerung der Belichtungszeit zur Folge. Wenn Fading-Effekte primär eine Rolle spielen, sollte immer das Objektiv mit der höheren Apertur eingesetzt werden!